ИССЛЕДОВАНИЕ ЭЯКУЛЯТА В КАМЕРЕ ГОРЯЕВА

Наиболее качественной и высокоэффективной является методика исследования эякулята в камере Горяева, позволяющая оценить как количественные, так и большинство качественных параметров сперматозоидов, их морфологию, а также клеточный состав исследуемого материала.

При проведении исследования обязательно должен соблюдаться принцип ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТИ!

Должна поддерживаться выбранная температура хранения эякулята. Для этого используются термостолики (набирающие оптимальную температуру в термостате и сохраняющие ее некоторое время в течение проведения микроскопического исследования) для исследуемого материала и для камеры Горяева.

Исследуемый эякулят в количестве 0,02 мл разводится в 0,4 мл физиологического раствора. Для точного получения нужного объема эякулята используются или стандартные капилляры для постановки СОЭ или дозаторы на 0,02 мл с одноразовыми пластмассовыми наконечниками. Последний вариант, безусловно, является более точным и современным.

При использовании капилляров:

1. Трудно засосать в капилляр ТОЧНО 0,02 мл эякулята.

2. Для более точного получения нужного объема необходимо обязательно убирать остающуюся каплю эякулята с кончика капилляра (кусочком ваты, бинта).

3. Как и весь многоразовый инструментарий, капилляры нуждаются в очень тщательном отмывании и стерилизации (воздействие чужеродных белков с внутренней поверхности капилляра может привести к нарушению качественных параметров сперматозоидов).

Физиологический раствор перед разведением необходимо согреть (на термостолике, в термостате).

Разведение эякулята в физиологическом растворе производится многократным пипетированием (засасыванием и выпусканием смеси).

Определенные трудности в получении точного объема и качественном разведении возникают при высокой вязкости эякулята при любом виде используемого инструментария.

1) Полученный эякулят оказывается негомогенным, что может исказить результат исследования. Перед забором материала необходимо произвести его взбалтывание и/или пипетирование.

2) При разрывании "нити" эякулята, растянувшегося между поверхностью и капилляром (наконечником дозатора), трудно точно сохранить полученный (0,02 мл) объем (или часть эякулята "выдирается" из капилляра или на его кончике формируется большая капля). Поэтому забор материала необходимо производить ОЧЕНЬ ВНИМАТЕЛЬНО, стараясь "отсечь" только необходимое для исследования количество материала.

3) Полученный комок слизи очень плохо растворяется в физиологическом растворе. Необходимо многократное пипетирование и размешивание кончиком пипетки (наконечником дозатора) до создания гомогенной массы (что приводит к выраженной механической травматизации сперматозоидов).

Камеру Горяева необходимо перед использованием тщательно протереть кусочком чистого бинта (вата может оставить волокна), слегка смоченного в 96о спирте (при сильном смачивании часть спирта может не успеть испариться и нарушить подвижность сперматозоидов). Так же необходимо обработать и покровное стекло. При низкокачественном спирте на поверхностях образуется осадок. Это приводит при проведении исследования к химической травматизации сперматозоидов. Тщательное протирание камеры и покровного стекла чистым марлевым шариком без спирта достаточно надежно очистит поверхности и предотвратит этот дефект. Притирание покровного стекла к камере должно быть очень тщательным до образования на месте контакта радужных колец (цветных колец Ньютона) С ОБОИХ КРАЕВ. Для более качественного притирания можно слегка выдохнуть воздух на камеру и покровное стекло, небольшое количество влаги сконденсируется на поверхностях и обеспечит их хороший контакт.

1. При отсутствии специальных покровных стекол, прилагающихся к камере Горяева, можно использовать обычные стандартные покровные стекла.

2. Необходимо нагреть камеру Горяева до температуры термостатирования эякулята (в термостате).

3. Лучше поместить камеру Горяева в термостолик (для предотвращения ее охлаждения в процессе проведения исследования).

4. Разведенный эякулят аккуратно заливается в щель между покровным стеклом и камерой так, чтобы заполнить все пространство.

РАЗВЕДЕНИЕ ЭЯКУЛЯТА В ФИЗИОЛОГИЧЕСКОМ РАСТВОРЕ, ПИПЕТИРОВАНИЕ, ЗАЛИВАНИЕ ЕГО В КАМЕРУ ГОРЯЕВА ЯВЛЯЮТСЯ ТРАВМИРУЮЩИМИ ФАКТОРАМИ И САМИ ПО СЕБЕ ПРИВОДЯТ К СНИЖЕНИЮ КАЧЕСТВЕННЫХ ПАРАМЕТРОВ СПЕРМАТОЗОИДОВ.

Нельзя производить микроскопическое исследование непосредственно после заливания в камеру разведенного эякулята (5-15 секунд), необходимо дать возможность механически "травмированным" сперматозоидам восстановить подвижность. Нельзя откладывать проведение исследования на 2-5 и более минут, особенно при низкой температуре камеры Горяева (постепенно падает подвижность сперматозоидов вплоть до полной остановки). ОПТИМАЛЬНЫМ ЯВЛЯЕТСЯ ПРОВЕДЕНИЕ МИКРОСКОПИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ ЧЕРЕЗ 0,5-1 МИНУТУ ПОСЛЕ ВНЕСЕНИЯ ЭЯКУЛЯТА В КАМЕРУ ГОРЯЕВА.

Микроскопическое исследование лучше всего проводить при увеличении 8х15 с опущенным конденсором.

После проведенного исследования кусочком бинта, слегка смоченного 96о спиртом, необходимо тщательно протереть рабочую область и места притирания камеры Горяева, а также внутреннюю поверхность покровного стекла.

При проведении микроскопического исследования эякулята в камере Горяева оцениваются следующие параметры:

1) КОЛИЧЕСТВО СПЕРМАТОЗОИДОВ В 1 МЛ ЭЯКУЛЯТА. Сетка в камере Горяева и расстояние от нее до покровного стекла подобраны таким образом, что КОЛИЧЕСТВО ЭЛЕМЕНТОВ, РАСПОЛОЖЕННЫХ В 5 БОЛЬШИХ КВАДРАТАХ СООТВЕТСТВУЕТ КОЛИЧЕСТВУ МИЛЛИОНОВ ЭТИХ ЭЛЕМЕНТОВ В 1 МЛ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА. Производится подсчет количества сперматозоидов в 5 больших квадратах камеры Горяева, расположенных по диагонали слева сверху направо вниз (для получения более точного результата при неравномерном распределении клеточных элементов). Лучше использовать большие квадраты, разделенные пересекающимися линиями на 16 маленьких. Это важно при очень большом количестве клеток, которые проще считать послойно по маленьким квадратам, чем в одном большом. Если сперматозоид расположен на границе квадрата, то он учитывается по расположению его головки (внутри квадрата - считается, вне квадрата - не считается).

ЕСЛИ СПЕРМАТОЗОИДОВ СЛИШКОМ МНОГО, НЕ ОБЯЗАТЕЛЬНО ПОДСЧИТЫВАТЬ ИХ В 5 КВАДРАТАХ. ЕСЛИ КОНЦЕНТРАЦИЯ СПЕРМАТОЗОИДОВ СЛИШКОМ НИЗКАЯ, НЕОБХОДИМО ПОДСЧИТАТЬ ИХ В БОЛЬШЕМ КОЛИЧЕСТВЕ КВАДРАТОВ (НАПРИМЕР В 5 ГРУППАХ ПО 4 КВАДРАТА). ОПТИМАЛЬНОЕ КОЛИЧЕСТВО ПОДСЧИТЫВАЕМЫХ СПЕРМАТОЗОИДОВ - 50-100 (ПРИ СЛАБОЙ ПОДВИЖНОСТИ - 100-150). В ЭТИХ СЛУЧАЯХ НЕОБХОДИМО ПРОИЗВЕСТИ ПЕРЕСЧЕТ КОЛИЧЕСТВА СПЕРМАТОЗОИДОВ НА 5 КВАДРАТОВ.

2. ПОДВИЖНОСТЬ СПЕРМАТОЗОИДОВ.

САМА ОЦЕНКА ПОДВИЖНОСТИ СПЕРМАТОЗОИДОВ И, ТЕМ БОЛЕЕ, РАЗДЕЛЕНИЕ ИХ ПО ГРУППАМ - ЭТО СУБЪЕКТИВНЫЙ КРИТЕРИЙ, ЗАВИСЯЩИЙ ОТ КВАЛИФИКАЦИИ ЛАБОРАНТА И НОРМ, ПРИНЯТЫХ В ДАННОЙ ЛАБОРАТОРИИ.

Наиболее простым является деление на подвижные и неподвижные сперматозоиды. Более сложным оказывается разделение подвижных сперматозоидов по типам движения.

Возможно разделение по способности к прогрессивному движению вперед и колебательному на месте. Тогда непонятно, к какому типу следует отнести сперматозоиды с манежным (круговым) движением, особенно если учесть, что радиус движения может составлять от 1-2 до 20-30 длин сперматозоида. Остается неясным, как расценить сперматозоиды, временно восстанавливающие свою подвижность при прохождении рядом активно-подвижного сперматозоида? Как подвижные или как неподвижные? Сперматозоиды в агглютинатах, сохраняющие высокую активность и, в принципе, способные к прогрессивному движению, тогда, наверное, также следует отнести к колебательным. А может быть вообще не надо учитывать сперматозоиды в агглютинатах?

Е. Молнар (1969) предложил оценивать подвижность сперматозоидов по 5-бальной шкале:

0 - отсутствие движения;

1 - дергающиеся на месте сперматозоиды;

2 - вялое, почти не прогрессирующее;

3 - слабопрогрессирующее движение;

4 - очень быстрое, целесообразное движение.

ВОЗ (1992 г.) предлагает разделение по нормам на категории - не менее 50 % с прогрессивным движением вперед (категории А и В) или не менее 25 % с быстрой линейной прогрессией (категория А), но не дает четких критериев разделения подвижных сперматозоидов на группы.

На основании нашего многолетнего опыта практически наиболее эффективным является деление на следующие группы:

1. Подвижные - с прогрессивным движением вперед и манежным движением с радиусом движения более 1 длины сперматозоида.

2. Колебательные - совершающие разной степени активности колебательные движения на одном месте, манежное движение с радиусом не более 1 длины сперматозоида, а также подвижные сперматозоиды в агглютинатах. К этой категории следует отнести и сперматозоиды, временно восстанавливающие свою подвижность и снова прекращающие движение.

3. Неподвижные - неподвижные сперматозоиды в полях зрения и в агглютинатах.

Подвижные сперматозоиды подсчитываются на момент первого взгляда на квадрат камеры Горяева, при этом учитываются все, которые покинули квадрат во время просмотра и не учитываются те, которые в это время переместились внутрь исследуемого квадрата. Сперматозоиды, совершающие колебательное движение подсчитываются во вторую очередь (или одновременно с подвижными). В конце просмотра подсчитываются неподвижные сперматозоиды. Если Вы слишком задержитесь с подсчетом, то ЧАСТЬ ПОДВИЖНЫХ СПЕРМАТОЗОИДОВ ПЕРЕСТАНЕТ ДВИГАТЬСЯ.

3. СКОРОСТНЫЕ ПАРАМЕТРЫ СПЕРМАТОЗОИДОВ оцениваются (с помощью секундомера) по скорости прохождения несколькими сперматозоидами (от наиболее высокоскоростных до низкоскоростных) большого квадрата камеры Горяева и могут выражаться в мм/мин., а также условно делиться на группы (высоко-, средне- и низкоскоростных). Точное определение скоростных параметров сперматозоидов - процесс достаточно трудоемкий (хронометрирование и пересчет по каждому сперматозоиду) и дающий, к тому же, слишком подробные данные, не удобные для клинического использования. Эта методика может применяться для обучения и тренинга лаборанта по определению скоростных параметров сперматозоидов, но с последующей заменой ее на более простую и удобную в практическом отношении. С практической точки зрения достаточным оказывается деление сперматозоидов по скоростным параметрам на 3 основные группы:

* высокоскоростные - (+++) - более 3,0 мм/мин (прохождение сперматозоидом большого квадрата камеры Горяева менее чем за 4 секунды);

* среднескоростные - (++) - 1,5-3,0 мм/мин (4-8 секунд);

* низкоскоростные - (+) - менее 1,5 мм/мин (более 8 секунд).

При наличии сперматозоидов с разными скоростными параметрами возможна форма записи типа +++/++ или +++/++/+.

4. АГГЛЮТИНАЦИЯ СПЕРМАТОЗОИДОВ также хорошо видна в камере Горяева. Степень агглютинации определяется процентом "склеившихся" сперматозоидов. Однако необходимо учесть, что часть агглютинатов будет "разбита" при размешивании эякулята в физиологическом растворе. Можно описывать также не только степень агглютинации, но и ее тип (агглютинация хвостами, головками или смешанная), а также размер образовавшихся агглютинатов (мелкие, крупные). О. Л. Тиктинский предлагает следующее деление степеней агглютинации: (+) - склеены только единичные сперматозоиды; (2+) - склеены только единичные сперматозоиды лишь головками; (3+) - около половины сперматозоидов склеены как головками, так и хвостами; (4+) - массовая агглютинация, склеены почти все сперматозоиды. Мы предлагаем следующий вариант определения степени агглютинации:

(+) - до 10-15 % сперматозоидов склеены в небольшие агглютинаты;

(++) - до 50 % сперматозоидов ск

леены как в небольшие, так и в крупные агглютинаты;

(+++) - массовая агглютинация, почти все сперматозоиды склеены в крупные конгломераты.

5. МОРФОЛОГИЯ СПЕРМАТОЗОИДОВ также лучше определяется в камере Горяева (при достаточно большом количестве сперматозоидов). Оценивается процентное соотношение в эякуляте морфологически нормальных и измененных сперматозоидов (в целом и по отдельным видам изменений), наличие головки у сперматозоида и ее размеры, состояние шейки, отсутствие или удвоение хвоста. Наиболее частые морфологические изменения у сперматозоидов следующие:

 отсутствие головки;

 чрезмерно крупная головка;

 удвоение головки;

 патология шейки с наклонным расположением на ней головки;

 отсутствие хвоста;

 удвоение хвоста;

 юная форма с цитоплазматической каплей в области шейки.

6. КОЛИЧЕСТВО КЛЕТОЧНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ в эякуляте. Наиболее часто и в наибольшем количестве встречаются клетки сперматогенеза, лейкоциты и эпителиальные клетки. Плоский ороговевающий эпителий представляет собой крупные клетки со слегка изрезанным неровным краем. Округлые клетки разного размера могут быть как клетками сперматогенеза, так и эпителиальными клетками, макрофагами, микрофагами, спермиофагами и, возможно, некоторыми другими видами клеток. Лейкоциты - округлые мелкие клетки отличаются от других клеток (визуально) толщиной клеточной стенки (как будто "обведены тушью"). Эритроциты при изменении глубины резкости выглядят как "баранки", чаще встречаются при получении эякулята после эндоуретральных манипуляций (например, взятия мазков). Количество клеточных элементов можно описывать следующим образом:

* До 1 млн./мл (кол-во клеток в 5 больших квадратах) - ед. в п\зрения;

* 1-2 млн./мл - небольшое кол-во;

* 3-5 млн./мл - умеренное кол-во;

* более 5 млн./мл - большое кол-во.

7. НАЛИЧИЕ НЕКЛЕТОЧНЫХ ЭЛЕМЕНТОВ в эякуляте. В небольшом количестве в эякуляте могут обнаруживаться лецитиновые зерна (липоидные тельца) в виде мелких темных точечных образований, располагающихся диффузно в семенной жидкости или, гораздо реже, входящие в состав слепков. Гиалиновые шары (амилоидные тельца) - это крупные округлые образования (крупнее эпителиальных клеток) с концентрическими дугами и окружностями, появляющимися при изменении глубины резкости, являются следствием застойных явлений в предстательной железе. Кристаллы Бехтера (ромбовидной или друзоообразной формы) различных размеров (от размера лейкоцита и крупнее) встречаются через 1 час после получения эякулята крайне редко, при суточном исследовании - гораздо чаще, с количественными и качественными показателями эякулята напрямую не связаны. Слизь - это, как правило, содержимое предстательной железы и семенных пузырьков, плотно обволакивает сперматозоиды, замедляя их подвижность и скоростные параметры, искажает точное определение количества и концентрации сперматозоидов.

8. НАЛИЧИЕ СЛЕПКОВ из клеток (лейкоциты и/или эпителий) и лецитиновых зерен. Иногда в состав слепков входят гиалиновые шары. Крупные неоформленные слепки (без лецитиновых зерен и гиалиновых шаров) носят уретрогенный характер. Слепки из предстательной железы менее крупные, часто колбасовидной формы (повторяют форму канальцев), состоят из клеточных и неклеточных элементов.
Оглавление