molochkov07-7

Хламидийная инфекция при хроническом простатите, диагностика.

Хламидийная инфекция при хроническом простатите, диагностика.


Современные методы выявления хламидийной инфекции делятся на две группы:
 
• методы непосредственного обнаружения возбудителей (их морфологических структур или антигенов) в биологических субстратах (соскобы со слизистых оболочек и др.) или выделение их в клеточных культурах;

• методы выявления антител к хламидиям в сыворотке крови больных.

 
Ни один из существующих методов непосредственного обнаружения хламидий в биологических субстратах не гарантирует безусловного 100% выявления хламидий у конкретного больного. К тому же употребление больным незадолго до исследования антибактериальных препаратов заметно снижает успех лабораторной диагностики, поэтому больные по крайней мере за 2 нед до исследования не должны принимать противомикробные антибактериальные препараты и за 1 мес - антибиотики тетрациклинового ряда.

Важным методом, который позволяет получать наибольшее количество достоверных результатов, является посев биологических субстратов (секрет предстательной железы, эякулят, моча, проба со слизистой оболочки уретры и др.) на клеточные культуры MacCoy, HeLa или L-929, предварительно облученные γ-лучами или обработанные иммуносупрессивными препаратами для повышения их чувствительности к хламидиям. Чувствительность метода оценивается в 85,7%, а специфичность - в 100% [Loeffetholz M.J. et al., 1992]. По данным J. Schachter и М. Grossman (1981), этот метод выявляет хламидий у 70 - 80% инфицированных людей. В лабораториях, использовавших повторные пассажи материала от лиц с негативными результатами предыдущего посева, удавалось дополнительно идентифицировать хламидий в 10 - 20% случаев [Sweet R.S., Gibbs R.S., 1995]. Необходимо отметить, что посевы на клеточные культуры весьма сложны, трудоемки, дорогостоящи и требуют относительно длительного времени (от 3 до 7 дней). Поскольку этим методом могут быть выявлены только жизнеспособные организмы, в процессе подготовки образцов следует использовать строгие температурные режимы хранения и специальные транспортные среды. Ограничением применения культурального метода является возможная неадекватность клинического материала. За счет малого числа клеток чувствительность культурального метода при анализе образцов, взятых из уретры мужчин, может быть ниже (50 - 70%), чем при использовании эндоцервикальных образцов. В связи с тем что измененные и нежизнеспособные хламидий могут не давать роста в культуре, но выявляться в одновременно выполняемых гибридомных тестах, культуральный метод выявления хламидий больше не рассматривается в качестве "золотого стандарта". В настоящее время таким расширенным "золотым стандартом" может считаться сочетание культурального и генного методов, т.е. в случае отрицательных результатов культурального исследования с целью обнаружения хламидий для его подтверждения проводят исследование с помощью полимеразной или лигазной цепной реакции.

Более точные и достоверные результаты даже при вялотекущем и асимптомном урогенитальном хламидиозе дает использование молекулярных зондов и техники амплификации ДНК. Существующие в настоящее время варианты этих методов позволяют использовать такие образцы, как отделяемое уретры, секрет предстательной железы, эякулят, моча, и получать результаты в течение 24 ч. Кроме того, они не требуют специальных условий хранения материала, а также относительно дешевы в сравнении с культуральным методом.

Из целого ряда методов амплификации нуклеиновых кислот для диагностики хламидийных инфекций урогенитального тракта в последнее время используются только три: полимеразная цепная реакция (ПЦР), лигазная цепная реакция (ЛЦР) и транскрибционная амплификация (ТА). Разрабатываются также методы с применением Qp-репликазы, копирующей РНК-матрицу (Gene Trak), и метод усиления сигнала с использованием расплетенной ДНК (Chiron Corp.) [Quinn Т.С., 1996].

Полимеразная цепная реакция (ПЦР). Основные принципы амплификации методом ПЦР были обоснованы К.В. Mullis в 1983 г. Применение метода связано с возможностью получения практически неограниченного количества специфической ДНК В последнее время ПЦР стала стандартным методом амплификации ДНК во многих молекулярно-биологических лабораториях. Суть метода состоит в том, что в геноме возбудителя выбирают участок с уникальной и стойкой последовательностью нуклеотидов, которая не встречается у других микроорганизмов. Затем синтезируют олигонуклеотидные праймеры ("затравки"), комплементарные последовательностям нуклеотидов с правого до левого конца выбранного для амплификации сегмента генома. Эти праймеры будут теми барьерами, "от" и "до" которых будет двигаться фрагмент ДНК - полимераза, которой и предстоит синтезировать очень много копий заданного сегмента ДНК. Когда в результате амплификации наберется достаточное количество антигенного материала, его идентифицируют стандартными методами.

В диагностике хламидиоза выделяют две области применения ПЦР: выявление ДНК хламидий и типирование их штаммов. В первой области созданы очень чувствительные и специфичные диагностикумы, во второй - ценные приемы эпидемиологического исследования.

ПЦР и ее варианты обнаруживают инфекцию по нескольким молекулам ДНК. Метод применяют при исследовании материала из уретры, секрета предстательной железы, эякулята и, что особенно перспективно, мочи (по своей природе содержащей малое количество хламидий). У больных с дизурией и частым мочеиспусканием лучше использовать для исследования образцы ранней утренней порции мочи или мочи, собранной хотя бы через какой-то промежуток времени после опорожнения мочевого пузыря. Чувствительность метода оценивается в 96,5 - 99%, специфичность - в 99,7-100% [Loeffetholz M.J. et al., 1992; Bass C.A. et al., 1993; Ossewaarde J.M., 1995]. Метод ПЦР технологичен и легко автоматизируется, позволяет получить результаты в течение 24 ч, не требует специальных условий хранения материала, относительно дешев в сравнении с культуральным методом.

Следует особо отметить, что при интерпретации результатов ПЦР необходима осторожность. ПЦР выявляет только небольшую часть генома микроорганизма, что не является критерием его жизнеспособности. Хламидийная ДНК может продолжать выявляться в течение месяца после окончания лечения антибиотиками. В будущем станет возможным применение методики ПЦР с количественным учетом результатов для мониторинга антибиотикотерапии [Ossewaarde J.M., 1995].

Лигазная цепная реакция (ЛЦР) - второй метод амплификации ДНК, впервые описанный в 1989 г. В его основе лежит лигирование олигонуклеотидов, комплементарных определенной ДНК-мишени. В методе используется способность ДНК-лигазы соединять две пары комплементарных олигонуклеотидов после их гибридизации с последовательностями мишени in vitro.

ЛЦР может применяться для анализа уретральных, эндоцервикальных образцов и проб мочи. Чувствительность ЛЦР при анализе уретральных образцов и проб мочи у мужчин составляла 98 и 93,5% соответственно, специфичность - 99% [QuinnT.C., 1996].

М. Chernesky и соавт. (1996) исследовали три порции мочи мужчин, обратившихся в клинику с ЗППП; каждую порцию (20 - 30 мл) исследовали такими методами, как определение эстеразы лейкоцитов ("Boehringer" Mannheim), "dipstick" (погружаемая в образец индикаторная палочка), ЛЦР, РАСЕ2 ("Gene-Probe"), Chlamydiazime, а также посев материала из уретры. В результате из 26 инфицированных хламидиями мужчин у всех были отмечены положительные результаты с пробами первой порции мочи, а у 3/4 пациентов - со второй и третьей порциями в ЛЦР. При проведении всех остальных тестов отмечена половина (или меньше) положительных результатов с первой порцией мочи, и только незначительная часть проб осталась положительной при исследовании в неамплификационных тестах последующих порций мочи.

Транскрипционная амплификация (ТА). Новый метод молекулярной амплификации C.trachomatis основан на применении амплификации посредством транскрипции (ТА) и гибридизационной защиты (ГЗ) для качественного определения рибосомной РНК C.trachomatis в уретральных (эндоцервикальных) образцах и пробах мочи у мужчин и женщин.

Амплификация специфической рибосомной РНК-мишени происходит с образованием промежуточных ДНК-продуктов. Амплифицированные последовательности рибосомальной РНК (ампликоны) выявляют с применением гибридизации нуклеиновых кислот. Используют комплементарный ампликону одноцепочечный ДНК-зонд, несущий хемилюминесцентную метку. Меченый ДНК-зонд гибридизируется с ампликоном с образованием стабильного гибрида РНК - ДНК. Отделение гибридов от зондов, не вступивших в реакцию гибридизации, проводят с помощью специального реагента в люминометре. Чувствительность метода при исследовании эндоцервикальных образцов оценивается в 86,1 - 93,9%, а специфичность - в 99,1-99,2% [Yang L.I. et al., 1991; Hosein I.K. et al 1992].

При исследовании мочи мужчин чувствительность ТА составляла 94,6%. Метод ТА позволил выявить C.trachomatis при анализе цервикальных образцов у 98,1%, при анализе мочи - у 99,5%, а при анализе двух видов образцов - у 100% женщин [Quinn Т.С., 1996].

Методы определения антигенов хламидии. В настоящее время только метод прямой иммунофлюоресценции (ПИФ) с МАТ против основного белка наружной мембраны (МОМР) или ЛПС хламидии (причем в исполнении компетентного исследователя) наиболее близок к соответствию таким критериям, как высокая чувствительность и специфичность, быстрота и простота исполнения. К наборам прилагаются контрольные стекла с участками, на одном из которых нанесены незараженные эпителиальные клетки, на другом - эпителиальные клетки, зараженные хламидиями (отрицательный и положительный контроль), что позволяет избежать ложных результатов. Чувствительность метода около 90%, специфичность - около 95% [Tamm M.R. et al., 1984].

При сравнении диагностической ценности наборов с МАТ для прямой идентификации хламидии в соскобном материале от больного "Chlamyset" фирмы "Orion Diagnostica" (Финляндия) и "Mocrotrak" фирмы "Siva" (США) было установлено, что их чувствительность по сравнению с положительными результатами культуральной диагностики хламидии составила 92% (в обоих случаях), а специфичность - 92,4 и 85,7% соответственно [Гомберг М.А. и др., 1986]. Практическим врачам следует учитывать, что результаты ПИФ зависят от того, кто проводит исследование, поскольку этот метод требует высококвалифицированной экспертизы [Taylor-Robinson D., 1995].

Средняя чувствительность метода в масштабах Голландии и Великобритании оценена в 55 - 75% [Ossewaarde J.M., 1995; Taylor-Robinson D. (1995).

По данным Нижегородского НИКВИ, частота выявления хламидии при прямом иммунофлюоресцентном исследовании с помощью диагностикума "Хламискан" составила 27,4%, "Хламитест" - 67%, "Хламоноскрин" - 19,4% [Жукова Г.И., 1996]. При этом отмечалось частое несовпадение положительных результатов, полученных параллельно разными методами.

Недостатком метода ПИФ является то, что обнаружение наружной мембраны хламидии еще не является доказательством наличия жизнеспособных хламидии. Он также малочувствителен при асимптомной и вялотекущей инфекции. Несмотря на это, в настоящее время для выявления хламидийной инфекции чаще всего используют именно ПИФ.

Методика постановки ПИФ. На предметное стекло наносят материал соскоба из уретры, предстательной железы и т.д и фиксируют ацетоном. Затем на высушенный препарат наливают противохламидийные МАТ, меченные флюорохромом. Если в исследуемом материале есть хламидии, то МАТ иммунными связями прочно прикрепляются к ним. Препарат затем промывают водой, удаляя не фиксированные к хламидиям избыточные МАТ. Препарат вновь высушивают и исследуют в люминесцентном микроскопе. Внеклеточно расположенные ЭТ воспринимаются при люминесцентной микроскопии как точечные ярко светящиеся зеленые образования на фоне красно-оранжевых эпителиальных клеток (рис. 16). Их размер около 1/100 размера окружающих клеток. РТ или ПТ, оказавшиеся в межклеточном пространстве, светятся так же, как ЭТ, но их размер в 2 - 3 раза больше. Все другие флюоресцирующие образования, различающиеся по форме, размерам и цвету, должны расцениваться как артефакты. Диагноз хламидиоза считается установленным, когда в препарате выявляется не менее 10 ЭТ на фоне характерно окрашенных эпителиальных клеток. Отрицательным считается результат, если в препарате определяются эпителиальные клетки, а ЭТ отсутствуют. Если при исследовании находят менее 10 светящихся образований, соответствующих по своим характеристикам ЭТ, то во избежание диагностических ошибок анализ рекомендуется повторить [Гомберг М.А. и др., 1986].

При интерпретации результатов ПИФ нужно помнить, что методами выявления антигенов хламидий хламидийные антигены обнаруживают и после проведения антибактериальной терапии. Хламидийная ДНК может выявляться в течение месяца после окончания курса лечения антибиотиками [Ossenwaarde J.M., 1995].

Применения экспертизы, как при ПИФ, не требуется при проведении различных иммуноферментных тестов (ИФА). Это явилось одной из причин довольно широкого их применения для выявления антигенов хламидий. В то же время D.Taylor-Robinson (1995) пишет: "Относительная простота исполнения привела к взрыву энтузиазма в отношении их использования, в значительной степени неуместному, так как даже лучшие из них недостаточно чувствительны для стабильного определения малых количеств элементарных телец". Кроме того, они дают ложноположительные результаты в 2 - 3% случаев. Так, тест "Chlamydiazyme" (Abbott Lab.) перекрестно реагирует с такими бактериями, как Gardnerella, Actinetobacter, Klebsiella, Streptococcus spp., если их концентрация в исследуемом материале достигает или превышает 105/мл.

Наименьшей чувствительностью отличаются применяемые для экспресс-диагностики методы, основанные на принципе иммунохроматографии. Их сущность заключается в том, что образцы клинического материала, содержащие C.trachomatis, реагируют со специфическими антителами, ковалентно связанными с цветным латексом. Образующийся комплекс антиген - антитело - латекс движется по полоске нитроцеллюлозного фильтра, формируя окрашенную зону. Тест прост в исполнении и дает результат через полчаса. По данным Ю.К.Скрипкина и соавт. (1996), совпадение результатов иммунохроматографии ("Clearview", "Unipath") с ПЦР составляет 75%, с ПИФ - 89%, тогда как при использовании тест-системы "Chlamy-Check-1" (Франция) совпадение результатов при сравнении с ПЦР составило только 60%.

По мнению D. Taylor-Robinson (1995), "клиницистам необходимо сознавать, что у значительной части (до 30%) пациентов с хламидиозом хламидий присутствуют в таких незначительных количествах, что не могут быть обнаружены никакими иммунными тестами, какой бы чувствительностью эти тесты ни обладали. В результате этого многие хламидийные инфекции протекают незамеченными, и не приходится удивляться тому, что продолжается почти неконтролируемая пандемия хламидиоза".

В недостаточно оборудованных лабораториях используется окрашивание препаратов по Романовскому - Гимзе, с помощью которого удается обнаружить только внутриклеточные включения (микроколонии) хламидий (рис. 17). Этот метод, несмотря на простоту, требует много времени, так как число клеток с включениями при урогенитальном хламидиозе невелико; кроме того, лаборант должен обладать определенным опытом, чтобы не принять за внутриклеточные включения разного рода артефакты. Микроскопия окрашенных таким образом препаратов не позволяет выявить более 15% инфицированных хламидиями мужчин и не более 40% инфицированных ими женщин при локализации поражения в мочеполовом очаге и в 45% - при глазной инфекции.

Методы выявления антител в сыворотке крови. При урогенитальном хламидиозе серологические методики диагностики применяются с некоторыми оговорками. В связи с тем что при урогенитальном хламидиозе возбудители локализуются в поверхностных слоях эпителия, при уретритах, цервицитах, конъюнктивитах антигенная стимуляция очень невелика и выработка антител ничтожна. Напротив, при простатитах*, эпидидимитах, генерализованных хламидиозах иммунный ответ бывает достаточным, чтобы его определить с помощью реакции непрямой гемагглютинации, иммунофлюоресценции, особенно ее микроварианта. Реакция связывания комплемента (РСК) малопригодна для диагностики урогенитального хламидиоза, так как позволяет определить только групповые антигены, малочувствительна и у больных хламидийными уретритами дает не более 15% положительных результатов [Доклад Научной группы ВОЗ, 1984].

* При хроническом простатите противохламидийные IgA и IgG выявляются в секрете предстательной железы и семенной жидкости [Mazzoli S. et al., 1995].

 
Для практического использования наиболее удобным и информативным методом диагностики хламидийной инфекции является метод прямой иммунофлюоресценции с МАТ. Наиболее чувствительным некультуралъным методом является метод ПЦР.

В будущем для диагностики инфекций со сходными клиническими признаками (в том числе связанных с хроническим простатитом), вызываемых различными патогенами, может стать необходимой мультиплексная молекулярная амплификация [Peeling R.W., Bruham R.C., 1996].

Следует особо подчеркнуть, что точность диагностики в большой степени зависит от качества взятия материала для исследования.

При цитологической методике выявления хламидий, в том числе с использованием моноклональных флюоресцирующих антител, больные не должны принимать антибиотики по крайней мере за 2 нед до начала обследования. Перед взятием материала больной не должен мочиться в течение 1-1,5 ч.

При взятии материала на хламидий следует учитывать, что оптимальным для персистенции и размножения хламидий является передний отдел уретры на глубине 2,5 - 5 см (у женщин - слизистая оболочка цервикального канала матки на глубине 1,5 см). Материал соскоба должен быть равномерно распределен тонким слоем по поверхности предметного стекла.


реферат по книге «Хронический уретрогенный простатит». В.А. Молочков, И.И. Ильин (М. “Медицина”1998)
Оглавление